摘 要
多宁DuoBioXTM 提供从研究型到生产型细胞培养生物反应器，Explore系列台式生物反应器定位于实验室阶段的上游工艺开发、优化和PC研究，规格从500 mL-15 L；Pro系列一次性生物反应器是符合GMP商业化要求的生产型设备，规模从50-2,000 L。
Explore系列是采用了卫星罐分布式布局的台式玻璃生物反应器，具有完全控制功能，能够支持0.6-15 L培养规模。软件采用了先进的SCADA架构，能够实现平行多联培养，数据采集和结果对比分析。
Explore系列平行生物反应器
Pro系列一次性生物反应器采用底部搅拌式罐体设计，可实现从50 L-2,000 L规模生物工艺的连续放大，结合多宁完全自主研发制造的3D一次性细胞培养袋，具有良好的生物相容性优点，其灵活的管路设计，满足各类复杂的上游工艺过程；Pro的搅拌通气一体设计，不仅能提供良好的混匀效果同时又保证了优异的气体传质性能。
Pro系列一次性生物反应器
细胞培养工艺放大一致性-对于工艺开发阶段的台式生物反应器来说，能够为后续的放大提供可靠的过程参数作为放大依据尤为重要，所以通常采用3 L-5 L生物反应器作为建立反应器工艺的开发起点以及持续优化的工具。本试验采用恒定单位体积功耗比（P/V）一致的基本放大原则，对Explore台式3 L规模至Pro 500 L规模的培养工艺一致性进行考察，证明两者之间的具有良好的放大一致性表现。
CHO 细 胞
本试验所采用的细胞株为重组CHO-K1细胞，该细胞表达的产物为一种双特异性抗体。CHO细胞，即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）,它是基因工程蛋白研究中最具有代表性的哺乳动物表达载体，是用来表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞。CHO细胞能够在无血清悬浮培养中以高密度生长，并且在延长的发酵周期中维持高水平的蛋白质表达。
超过70%的蛋白质药物，如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗等的首选制造细胞都是CHO细胞。目前我们常用的CHO细胞系有：CHO-K1、CHO-DXB11、CHO-S、CHO-DG44、CHO-GS等。
方 法 与 材 料
培养基
基础培养基：Media C（包括种子培养）
补料培养基：DN feed 2，DN feed B2
细胞株
CHO-K1
生物反应器系统
DuoBioXTM Explore系列平行生物反应器 规格3 L
DuoBioXTM Pro系列一次性生物反应器 规格200 L，500 L
操作方式
批次流加（Fed Batch），初始培养体积一般小于罐体最大工作体积，留出的空间将在后续的培养过程中进行多次间歇性补料，所以培养体积会逐渐增加直至培养结束。细胞接种后会消耗初始培养基中的营养成分（如碳源、氮源）用于生长。随着细胞密度不断增加，罐内营养成分会越来越少，同时代谢副产物不断累积，通过补料可以及时补充细胞所需的营养成分，使细胞密度进一步增加，当代谢副产物累积至细胞生长受到影响，细胞密度和活率也会从高峰开始呈下降趋势。
pH控制
酸调节采用向培养体系中1 mm鼓泡通入CO2气体下调pH值。
碱调节通过蠕动泵向罐内泵入碱溶液如Na2CO3，NaHCO3或NaOH等上调pH值。
通常情况下CHO细胞培养合适的pH环境范围为7.0-7.2。本试验中，罐内pH值通过pH电极在线测量，根据测量值自动反馈调节CO2 质量流量计流速和碱泵转速. pH控制死区设为±0.2，可以有效防止pH调节过冲。
DO控制
通过向罐内内通入不同种类的气体来实现培养体系的溶氧控制。向罐内鼓泡通入Air和O2的方式用来提高DO，而N2可以用来控制DO的下调，实现较低的DO水平甚至无氧环境维持。因氧气在培养基中的溶解度较低，其传质效率受底部通气的比表面积、接触时间影响。大多数哺乳动物细胞生长溶解氧适宜范围通常在20%-60%之间。培养基的溶解氧通过光学DO电极在线监测，根据测量值自动反馈调节MFC-O2 流量。
本试验中Explore台式生物反应器底部Sparger的孔径采用1 mm大泡，桨叶为经典单层三叶式，叶片角度呈45°倾斜，在产生向下的轴向流同时也能降低搅拌对细胞的剪切力。Pro一次性生物反应器培养初期采用1 mm大泡底部通气，通气策略采用大泡和微泡组合方式，当VVM达到0.3后，可开启20 µm底部微泡通气Sparger作为补充。
补料控制
根据Fed Batch操作方式特点，培养过程中需要定时补料，所以补料控制通过Explore台式反应器控制器的Auxiliary模拟4-20 mA输入接口连接外置台秤，Pro自带罐体称重Load Cell，两套系统通过重量控制内置Feed In蠕动泵进行自动补料，补料时间点及频次通过在控制软件中编程预设，自动完成。
参数设定与控制策略-批次流加
工艺条件 | Explore-3L | Pro-200L | Pro-500L |
培养体积 | 1L | 160L | 460L |
接种密度 | 1.5E6 cells/ml | ||
培养时间 | 16天 | ||
温度 | 36.5℃ 第四天降温至33℃ | ||
pH | 7.0±0.2 | ||
DO | 40% | ||
培养基 | 基础Media C，补料 DN feed 2 & DN feed B2，多宁 | ||
补料策略 | 3% DN feed 2+0.3% DN feed B2 从第三天开始 | ||
取样 | 每天 | ||
反应器配置表
I/O | Explore-3L | Pro-200L | Pro-500L |
温度电极 | Pt-100 | ||
pH 电极 | 化学凝胶电极 梅特勒托利多 | ||
DO 电极 | 光学数字电极 Hamilton | ||
底部通气 | 1mm大泡，7孔L分布 | 1mm大泡，20µm微泡 | 1mm大泡，20µm微泡 |
表层通气 | 转子流量计 0-1000mLPM | MFC-Air | MFC-Air |
蠕动泵 | 4* Watson-Malow 114D | 2xWatson Marlow 114D 2xWatson Marlow 313D | 2xWatson Marlow 114D 2xWatson Marlow 313D |
尾气 | 半导体冷却（Peltier） | 电加热 | 电加热 |
罐体 | Explore-3L | Pro-200L | Pro-500L |
罐体及控温 | 玻璃，电毯加热 | 不锈钢水夹套 | |
最大工作体积 | 2L | 200L | 500L |
最小工作体积 | 0.6L | 40L | 100L |
桨叶 | 三斜叶 | 三斜叶，底搅拌 | |
准数Np | 1.5 | 1.15 | |
罐内高径比 | 1.5:1 | 1.6:1 | 1.5:1 |
P/V | 28 W/m3 | ||
活细胞密度和活率
细胞代谢和渗透压
蛋白浓度
结 论
按照等P/V一致的放大基本原则，对CHO-K1细胞Fed Batch培养工艺顺利实现从3 L台式反应器至200 L和500 L规模一次性生物反应器的工艺放大，细胞生长表现及蛋白产量(>4 g/L) 具有良好一致性表现。
订 购 信 息
培养基产品信息
货号 | 产品名称 | 产品规格 |
M028-001 | Media C | 1L 液体 |
MP028-001 | Media C | 100g 粉末 |
MP028-010 | Media C | 1kg 粉末 |
MP028-100 | Media C | 10kg 粉末 |
FT002-1L | DN feed 2 | 1L 液体 |
FP002-100g | DN feed 2 | 100g 粉末 |
FP002-1kg | DN feed 2 | 1kg 粉末 |
FP002-5kg | DN feed 2 | 5kg 粉末 |
FT003-300mL | DN feed B2 | 300mL 液体 |
FP003-100g | DN feed B2 | 100g 粉末 |
FP003-1kg | DN feed B2 | 1kg 粉末 |
生物反应器产品信息
货号 | 产品名称 |
SDE-00-01-3 | Explore 3L生物反应器系统 单罐 |
SDE-00-04-3 | Explore 3L生物反应器系统 四联罐 |
SDE-00-08-3 | Explore 3L生物反应器系统 八联罐 |
SDP-00-00-0050 | Pro-50L 一次性生物反应器 |
SDP-00-00-0200 | Pro-200L 一次性生物反应器 |
SDP-00-00-0500 | Pro-500L 一次性生物反应器 |
SDP-00-00-1000 | Pro-1000L 一次性生物反应器 |
SDP-00-00-2000 | Pro-2000L 一次性生物反应器 |
*详细产品信息，请联系marketing@duoningbio.com
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